上海光源用户在结构生物学、材料学研究方面取得新成果

2013/12/18 | 【 【打印】【关闭】 | 访问次数:

1、Lsm蛋白质复合物特异性识别剪切体U6 RNA的分子机制 

11月17日,清华大学生命学院施一公教授研究组在《自然》杂志在线发表了题目为“Crystal structures of the Lsm complex bound to the 3′ end sequence of U6 small nuclear RNA”(Lsm蛋白质复合体结合U6小核RNA 3′末端序列的晶体结构)的研究论文,首次报道了Lsm2-8蛋白质复合物自组装的晶体结构及其特异识别U6小核RNA 3′末端序列的分子机制。 

在真核生物中,执行翻译功能的信使RNA(messenger RNA)在细胞核内的成熟需要经历一个非常复杂的剪切和拼接过程,这个过程主要是由五个小核核糖核蛋白(small nuclear ribonucleoproteins,snRNP)和一系列的辅助蛋白构成的巨大分子机器——剪切体(spliceosome)执行的。每种snRNP都由一条小核RNA(small nuclear RNA)和与之特异性结合的七元环蛋白质复合物组成。大部分的七元环复合物是Sm 蛋白质七聚体,只有在U6小核核糖核蛋白中为Lsm蛋白质七聚体复合物。Lsm蛋白家族有十多个成员,在各个物种中高度保守,参与各种与RNA代谢相关的信号通路。在真核细胞中,组成U6小核核糖核蛋白的蛋白质复合物是Lsm2/3/4/5/6/7/8。它能够特异地识别U6 RNA的3′末端序列,并帮助U6 RNA与剪切体其他成员相互作用,催化RNA的剪接过程。 

在这篇研究论文中,施一公研究组通过特殊的蛋白质表达手段获得了均一性和稳定性良好的自组装Lsm蛋白质复合物,克服了传统Lsm蛋白提取方法对蛋 白质造成的潜在变性危害。在此基础上,作者对蛋白质复合物和RNA片段进行了共结晶,并利用上海光源生物大分子晶体学线站(BL17U1)解析了复合体的晶体结构,结合结构生物学和生物化学的分析手段,揭示了Lsm2-8七聚体蛋白质复合物特异性识别U6 snRNA末端的分子机制。Lsm2-8蛋白质复合物中的四个亚基Lsm4/8/2/3分别使用两个保守的序列模式特异性地把U6 RNA 3′末端4个尿嘧啶锚定在七聚体圆环形成的中间空腔内,其中Lsm3识别最末位的尿嘧啶核苷酸。有趣的是,当这个核苷酸被截去之后,Lsm3仍可以以及其相似的识别模式锚定最后一个尿嘧啶,引起整个结合序列的后移。除与Lsm4相邻的Lsm7对RNA的结合贡献了微弱的氢键以外,其他两个亚基并没有直接参与到RNA识别中去。这一创造性的新发现首次从三维晶体结构上描述和解释了Lsm蛋白对U6 RNA的“末端识别”模式。

由于剪接通路的动态复杂性,自1993年基因剪接的发现被授予了诺贝尔生理学医学奖以来,科学家们仍在步履维艰地探索着其中的奥秘。此课题的完成攻克了世界上多个研究组感兴趣的难题,将七个不同蛋白质共同表达并结晶。为此领域的相关研究提供了新的设计思路和研究方法。Lsm蛋白质复合物晶体结构的解析是施一公研究组首次在RNA剪接通路中取得的重大进展,为更好地理解真核生物剪接体的功能实现和揭示生命现象的基本原理奠定了夯实的理论基础。

图示 Lsm2-8复合物与U6 RNA的特异性识别

2、揭示DNA去甲基化过程关键酶TET的催化机制 

哺乳动物TET蛋白在受精卵表观遗传重编程、多能干细胞分化、骨髓造血等关键生命过程中扮演着至关重要的角色,其失活也与多种疾病,尤其是血液肿瘤的发生密切相关。12月5日,复旦大学生物医学研究院徐彦辉研究组在国际顶级学术期刊《细胞》在线发表了题目为“Crystal Structure of TET2-DNA Complex: Insight into TET-mediated 5mC Oxidation”(TET2蛋白质结合DNA的晶体结构揭示5-甲基胞嘧啶氧化机制)的研究论文。该研究在国际上首次解析出TET2蛋白的晶体结构,揭示了其特异识别并氧化5-甲基胞嘧啶的分子机制,阐明了血液肿瘤中TET2突变导致其酶活性降低的机理。该研究为TET蛋白介导的DNA甲基化动态调控机制提供了新视角,高分辨率TET2-DNA复合物结构的解析,也为靶向TET蛋白激活剂和抑制剂的研究奠定了重要的结构生物学基础。 

DNA胞嘧啶的5位甲基化(5mC)是一种重要的表观遗传修饰,它参与基因调节、基因组印记、X-染色体失活和癌症发生等过程。DNA甲基化的水平主要由甲基化和去甲基化这两个方向来协同调控,目前对甲基化途径的研究已经比较清楚,但是DNA去甲基化的调控机制却长期困扰科学界。具有氧化5-甲基胞嘧啶能力的TET蛋白于2009年被鉴定,立即引发了全世界科学家的广泛关注,TET蛋白也成为近年来生命科学研究中的“明星”分子。TET 蛋白家族的3个成员TET1、TET2和TET3均属于-酮戊二酸(-KG)和二价铁离子(Fe2+)依赖的双加氧酶,利用分子氧将5mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),并继续催化5-hmC转化为5-甲酰胞嘧啶(5-fC)和5-羧基胞嘧啶(5-caC)。TET家族蛋白氧化5mC而产生的5hmC也是重要的表观遗传修饰,在很多生命过程如减数分裂和印记基因的表观重编程、转录调控以及肿瘤发生和发展过程中起到关键作用。而5-fC和5caC可由碱基切除修复系统转换成胞嘧啶从而完成去甲基化过程。虽然近年来对于TET蛋白家族的功能已经有了深入的理解,TET家族蛋白的三维结构一直未能获得解析,无法从分子水平理解TET蛋白识别5mC底物的机制及其催化机理。

为了揭开这一谜题,徐彦辉研究组的研究人员选择了骨髓肿瘤中突变率很高的TET2为研究对象,将TET2蛋白质和甲基化DNA片段进行共结晶,最终利用上海光源生物大分子晶体学线站(BL17U1)获得了2.02埃高分辨率的TET2-DNA复合物晶体结构,结合生物化学的分析手段揭示了TET蛋白识别底物5mC的分子机制。TET2蛋白采用了一种从未被报道过的蛋白质折叠方式,其氨基端的半胱氨酸富集结构域(Cys-Rich)“缠绕”着羧基端的催化结构域(DSBH),双链DNA位于催化结构域上方,由Cys-Rich结构域伸出的卷曲结构通过疏水作用将DNA双螺旋“撬开”,进而5mC翻出来并插入到催化口袋中,使5mC的甲基指向具有催化活性的二价铁离子(Fe2+)和-酮戊二酸(-KG),进而完成5mC的氧化过程。研究人员对TET2突变体酶活检测的生化实验结果表明,与骨髓肿瘤发生相关的TET2突变体严重影响蛋白本身的稳定性或其对底物的识别能力,从而大大降低了TET2的酶活性。这说明TET2 的酶活性可能对骨髓生成至关重要,其突变造成的酶活性破坏可导致骨髓生成异常而引发肿瘤。完成该课题过程中,研究人员为克服蛋白制备难题所开创的方法为此领域的相关研究提供了新的设计思路,也为基于TET蛋白活性的新型DNA测序技术的大规模应用提供了可能,极大地拓宽了TET蛋白在生物技术应用上的前景。

图示 TET2专一性识别甲基胞嘧啶

3、材料研究进展 

  • 短碳纤维/环氧复合材料动态破坏过程研究 

中国科学技术大学胡小方、许峰课题组利用上海光源先进成像与工业应用线站(BL13W1)的同步辐射显微CT平台,研制和发展SR-CT专用的力学实验装置,完成了碳纤维增强聚合物复合材料微纳米力学行为和金属、陶瓷微波烧结热力学和动力学演化的SR-CT实验研究,相关成果分别发表在CarbonActa Materialia上。

碳纤维增强聚合物复合材料在强度、刚度、耐腐蚀性方面均具有优异的性能,氧化处理可以提高其表面性能,促进与基体的粘合,从而进一步改善复合材料的性能。为了研究复合材料的失效机制及纤维表面氧化处理对复合材料力学性能的影响,该课题组利用高分辨率SR-CT成像技术对复合材料的断裂力学过程进行了在线实验研究,通过对比分析氧化处理前后样品中的纤维断裂长度、断裂纤维含量和材料拉伸强度等宏、微观力学参量,发现经过氧化处理的短碳纤维复合材料允许更高的极限载荷,为数值建模及进一步研究纤维复合材料的应力传递理论提供了实验基础。该项成果发表在carbon期刊,题为“In situ observations of fractures in short carbonfiber/epoxy composites”(carbon,2014;67:368-376,http://dx.doi.org/10.1016/j.carbon.2013.10.007)。

图示 短碳纤维/环氧复合材料断裂过程SR-CT三维重建图像

  • 陶瓷微波烧结机理研究 

微波烧结是近年来发展起来的一种新型快速材料制备技术,利用该方法能有效地改善金属、合金和陶瓷材料性能。为了研制金属、陶瓷及其混合体系在微波电磁场中的不同烧结机制,该课题组将其研制的SR-CT专用微波烧结设备与BL13W1线站的SR-μCT方法相结合,实现了SiC-Al混合体系微波烧结过程的原位在线实验研究,从显微组织演变和烧结动力学的角度对实验结果进行了分析,给出了陶瓷材料和金属材料不同的微波作用机制——介电损耗和涡流损耗,进一步分析了界面极化、微区聚焦等特殊的微波作用机理,并将实验分析结果与金属铝的微波烧结进行了对比,为研究微波和金属、陶瓷之间的混合相互作用机制提供了实验支持。该项成果发表在《Acta Materialia》期刊,题为“In situ investigation on the mixed-interaction mechanisms in the metal–ceramic system’s microwave sintering”(Acta Materialia,2013;http://dx.doi.org/10.1016/j.actamat.2013.11.017)。(生命科学研究部、先进成像与工业应用部  供稿)

图示 SiC-Al微波烧结显微组织演化图像

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